昆山市超声仪器有限公司
本实验以三球悬铃木成熟果球为材料，探讨了不同消毒方式、无机盐浓度对其种子萌发的影响，以及叶龄、光照对叶片愈伤组织诱导和植物生长调节剂浓度对不定芽分化的影响，初步建立三球悬铃木果球离体培养技术及高效的叶片再生体系，以期为促进三球悬铃木离体植株再生和苗木的推广提供参考。
1 材料与方法
郑州大学校园内生长健壮的6 年生三球悬铃木的成熟果球。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 种子消毒
剥离果球中的种子，先用自来水冲洗1 h，再用含洗涤剂的溶液揉洗10 min，然后用自来水冲洗干净。用无菌滤纸吸干种子表面水分后，先用75 %乙醇浸泡30 s，然后用含少量Tween-20 的10 %H2O2进行不同时间( 5 min、10 min、15 min、20 min)的消毒处理，然后将种子分别播种于EX 培养基( 与李思等的种子无菌萌发培养基成分相同) 和MS培养基中，光照培养( 光照强度1 500 Lx、光周期16 时/天、温度25℃) 45 天后，观察无菌苗的生长状况，统计种子的萌发率和污染率，分析消毒时间、无机盐浓度对无菌苗种子萌发的影响。
2 结果与分析
2. 1 三球悬铃木果球离体培养和无菌苗的获得
2. 1. 1 污染问题
在培养初期，因三球悬铃木种子较小，果毛较多，种皮较厚，利用常规的消毒方法( 0. 1 %HgCl2消毒10 min 和10 %NaClO 消毒20－30 min)消毒后，萌发过程中仍污染严重，即使延长消毒时间，污染仍然严重，且由于消毒剂对种子长时间的毒害作用，导致种子萌发率低，无菌苗长势差，生长缓慢，褐化严重，阻止了离体培养无菌苗在短时间内的获得，成为系统构建三球悬铃木再生体系的重大障碍。H2O2毒性较小，且低浓度有打破种子休眠作用。图1 表明，使用H2O2作为消毒剂，随着消毒时间的增加，种子污染率下降，萌发率也随之降低，当消毒时间为10 min 时，可在不影响萌发率的前提下将污染率降到最低，且无菌苗长势较好，组培苗无褐化现象。
3 结论与讨论
选择合适的外植体是建立再生体系的重要前提。植物不同时期、不同部位、不同来源的材料都可以作为再生体系建立的外植体。悬铃木的再生多以当年生枝条、2－3 年生枝条、叶片和下胚轴为外植体，但当年生或2－3 年生枝条的取材易受季节限制，而下胚轴又不易大量获得。三球悬铃木果球成熟后，可长期保存，本实验采用无菌苗叶片作为再生外植体，将成熟果球上剥离的种子用75 %乙醇浸泡30 s，含少量Tween-20 的10 %H2O2消毒10 min 后，播种于低盐成分的EX 培养基上，可明显提高其种子的萌发率，为组织再生提供大量的外植体。用10 %H2O2消毒处理时，时间过短，种子污染率大，时间过长，种子的萌发率急剧下降，因此选择合适的消毒时间( 10 min) ，才能在保证萌发率的前提下降低污染。
恒温光照培养（上海一恒科学仪器有限公司）的条件对叶片的脱分化有重要影响，叶片先经过7 天的黑暗培养，再转入光照培养，愈伤组织诱导率比直接光照培养的高约30. 67 %，且愈伤组织致密、生长状态良好，不易褐化死亡。这与刘国锋等的研究结果强光会抑制愈伤组织的形成和生长，进而不利于芽的分化是一致的。此外，经历黑暗培养，可以促进不定芽的分化。
